세균 배양 실험 방법 - segyun baeyang silheom bangbeob

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지난 시간에 우리는 ‘용액 만들기’라는 주제로, 생명과학 실험에서 꼭 필요한 다양한 용액을 만드는 방법에 대해 알아봤습니다. 생명과학 실험에서는 다양한 세포를 활용하는데, 그러기 위해서는 세포를 잘 키우는 것이 필요합니다. 이번 시간과 다음 시간에는 ‘세포 키우기’라는 주제로 다양한 세포를 키우고 관리하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다. 우선 이번 시간에는 세균을 키우는 원리에 대해 알아보고, 다음 시간에는 세균을 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보겠습니다. 세균을 키우는 원리와 방법을 알아본 다음에는 포유류 세포를 키우는 원리와 방법에 대해 알아보겠습니다.

세균은 왜 키울까요? 세균은 포유류 세포 등 다른 세포를 키울 때에 비해서 여러 장점을 가지고 있습니다. 우선 세균은 빠르게 분열하기 때문에 대량으로 배양하기 용이합니다. 또한 세균은 반수체(haploid)이고, 플라스미드(plasmid) 등을 이용하여 형질전환하기도 쉽습니다. 그리고 세균을 키울 때 사용하는 배지는 통상적으로 포유류 세포 등 다른 세포를 키울 때 사용하는 배지보다 저렴합니다. 그렇기 때문에 세균은 유전공학적으로 형질전환하고, 대량의 단백질을 생산할 때 매우 유용하게 이용됩니다. 물론 항생제 내성 연구, 세균 및 그 부산물로 인한 염증 반응 연구 등 세균 자체를 연구에 이용할 때도 당연히 세균을 키우는 것은 꼭 필요합니다.

세균을 분류할 때 많이 사용되는 기준으로 우선 그람 염색법(Gram staining)이 있습니다(그림 1). 그람 염색법은 덴마크의 세균학자 한스 그람(Hans Christian Gram, 1853-1938)이 최초로 개발한 기술로서, 세균에 따라 세포벽/세포막의 구조가 다른 것을 이용합니다1). 그람 음성 세균(Gram-negative bacteria)의 경우 세포벽이 얇고, 세포벽 안팎으로 내막(inner membrane)과 외막(outer membrane)이 존재하며, 그람 양성 세균(Gram-positive bacteria)의 경우 세포벽이 두껍고, 세포벽 안쪽에 세포막(cytoplasmic membrane)이 존재하고 외막은 존재하지 않습니다. 그람 염색법은 세균을 슬라이드 글라스에 도말한 뒤 가열하여 고정시키는 것으로 시작합니다. 그다음 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 1차 염색을 하고, 아이오딘(iodine)을 추가하여 크리스탈 바이올렛을 세포벽에 남아 있게 하고, 에탄올이나 아세톤을 이용하여 탈색합니다. 마지막으로 사프라닌(safranin)을 이용하여 2차 염색을 합니다. 그람 염색법으로 염색을 하면 그람 음성 세균은 세포벽이 얇아 크리스탈 바이올렛을 가지고 있지 못해서 분홍색(사프라닌의 색깔)을 띄게 되고, 그람 양성 세균은 세포벽이 두꺼워 크리스탈 바이올렛이 침착되어 보라색(크리스탈 바이올렛의 색깔)을 띄게 됩니다. 그람 염색법은 세균의 구조 차이를 기반으로 세균을 분류할 수 있게 해주기 때문에, 세균을 동정하는데 있어 매우 유용합니다.
 

그림 1. 그람 염색법. 그람 염색법은 세균에 따라 세포벽/세포막의 구조가 다른 것을 이용한 염색법으로, 세포벽이 얇은 그람 음성 박테리아의 경우 분홍색(사프라닌의 색깔), 세포벽이 두꺼운 그람 양성 박테리아의 경우 보라색(크리스탈 바이올렛의 색깔)을 띄게 됩니다.

세균을 분류할 때 산소에 대한 선호도도 활용됩니다. 세포 호흡에 산소가 이용되면 그렇지 않은 경우에 비해 에너지를 더 많이 생산할 수 있는 반면 산화 스트레스(oxidative stress)가 발생하기도 합니다. 세균들을 산소에 대한 선호도로 분류하면 다음과 같습니다: 1) 완전 호기성 세균(Obligate aerobes): 산소 호흡(aerobic respiration)만 가능하고, 발효 등의 무산소 호흡(anaerobic respiration)이 불가능함; 2) 완전 혐기성 세균(Obligate anaerobes): 산소가 있으면 죽고, 발효 등의 무산소 호흡만 가능함; 3) 조건부 혐기성 세균(Facultative anaerobes): 산소 호흡도 가능하고 무산소 호흡도 가능함. 산소 호흡을 통해 더 많은 에너지를 생산할 수 있으므로, 산소 호흡을 선호함; 4) 미세 호기성 세균(Microaerophiles): 산소를 필요로 하지만, 저농도의 산소를 필요로 하고, 고농도의 산소가 있으면 죽음; 5) 산소 내성 세균(Aerotolerant organisms): 산소를 필요로 하지는 않지만 산소가 있어도 죽지 않음. 이들을 배지가 든 시험관에 넣고 배양할 경우 산소 선호도에 따라 서로 다른 위치에 분포하게 됩니다(그림 2).
 

그림 2. 산소 선호도에 따른 세균 분류. 시험관에 배지를 넣고 산소 선호도가 다른 세균들을 배양해보면 산소 선호도에 따라 시험관의 다른 위치에 분포합니다: 1) 완전 호기성 세균: 시험관 가장 윗부분에 집중(산소 농도 높음); 2) 완전 혐기성 세균: 시험관 가장 아랫부분에 집중(산소 농도 낮음); 3) 조건부 혐기성 세균: 시험관 전체적으로 분포하나 시험관 가장 윗부분에 좀 더 많음; 4) 미세 호기성 세균: 시험관 윗부분에 모이지만 가장 윗부분에는 적음; 5) 산소 내성 세균: 시험관 전체적으로 분포함.

그리고 세균에만 해당하는 것은 아니지만 생물체 위험군에 따라서도 분류할 수 있습니다(표 1). 생물체 위험군이란 생물체를 생물 안전 등급(Biosafety level, BSL or BL)에 따라 분류한 것으로, 크게 제1위험군, 제2위험군, 제3위험군, 제4위험군으로 분류됩니다2). 우선 제1위험군은 건강한 성인에게 질병을 일으키지 않는 생물체입니다. 다음으로 제2위험군은 사람에게 발병한 경우, 증세가 경미하고 예방 및 치료가 용이한 질병을 일으키는 생물체입니다. 또한 제3위험군은 사람에게 발병한 경우, 증세가 심각하거나 치명적일 수 있으나 예방 및 치료가 가능한 질병을 일으키는 생물체입니다. 마지막으로 제4위험군은 사람에게 발병한 경우, 증세가 매우 심각하거나 치명적일 수 있고 예방 및 치료가 어려운 질병을 일으키는 생물체입니다. 각 위험군을 취급할 때는 생물 안전 등급 1등급~4등급의 설치/운영 기준을 준수해야 합니다. 세균은 제1위험군, 제2위험군, 제3위험군까지 속하며 제4위험군에 해당하는 세균은 현재까지 알려진 바 없습니다주1).
 

표 1. 생물체 위험군. 생물체 위험군은 생물 안전 등급에 따라 생물체를 분류한 것으로 위험도에 따라 제1위험군~제4위험군으로 나뉘며, 각 위험군을 취급할 때는 생물 안전 등급 1등급~4등급의 설치/운영 기준을 준수해야 합니다.

생명과학 실험에 많이 사용하는 대장균(Escherichia coli)은 그람 음성 세균이고, 조건부 혐기성 세균입니다. 대장균은 이름에서 알 수 있듯이 대장(large intestine)에서 유래한 세균이고, 병원성 대장균 계통은 장염, 요로감염 등 다양한 질병을 일으킬 수 있지만3), 생명과학 실험에 사용되는 대장균은 비병원성으로 제1위험군에 속합니다주2). 생명과학 실험에 많이 사용되는 대장균의 계통으로는 K-12가 있고, 세부 계통으로는 MG1655, W3110, DH5α, JM109 등이 있습니다. 이들은 모델 생물로서 빠르게 분열하며, 유전자 조작이 간편하고, 배양이 용이하여 생명과학 실험에서 많이 활용되고 있습니다.

세균을 배양할 때는 여러 가지 요소들을 고려해야 합니다(그림 3). 우선 배지를 고려해야 합니다. 세균을 배양할 때 사용하는 배지는 액체 배지와 고체 배지가 있으며, 대량으로 배양할 때는 주로 액체 배지를 사용하고, 개별 콜로니를 확인하거나 숫자를 셀 필요가 있을 때는 한천(agar)를 넣어 만든 고체 배지를 사용합니다. 또한 세균을 배양할 때는 해당 세균이 필요로 하는 영양 – 탄소/수소/산소/질소/인/황 공급원, 염 등- 을 충분히 공급해줄 수 있어야 합니다. 대장균을 배양할 때 많이 사용되는 배지가 lysogeny broth(LB)입니다주3). LB는 트립톤(tryptone, 카제인(casein) 단백질을 트립신(trypsin)으로 분해하여 만든 펩타이드 혼합물), 염화나트륨(sodium chloride), 효모 추출물(yeast extracts)로 구성되어 있어 대장균을 배양할 때 필요한 영양을 충분히 공급해 줄 수 있습니다. LB 외에도 super optimal broth(SOB), SOB with catabolite repression(SOC), trypticase soy broth(TSB), brain heart infusion(BHI) 등의 다양한 배지가 사용됩니다. 앞서 언급한 배지들은 모두 화학 성분이 명확히 규정되지 않은 배지(chemically undefined medium)이며, 이와 달리 화학 성분이 명확히 규정된 배지(chemically defined medium; M9 minimal medium 등)를 사용하는 경우도 있습니다.

그리고 오염 방지를 위해 배지를 만들 때는 3차 정제수를 포함하여 배지를 구성하는 성분을 멸균해야 하는데, 대체로 멸균처리기(autoclave)를 이용하여 121oC, 15 psi, 15분간 멸균합니다. 멸균처리기를 사용할 수 없는 성분(주로 sugar 종류, 항생제 등)을 멸균할 때는 청정실험대(clean bench)에서 해당 성분을 녹인 용액을 필터(주로 0.22 μm pore-sized filter)한 다음 멸균처리기로 멸균하고 충분히 식힌 다른 구성 성분과 혼합하여 사용합니다. 액체 배지의 경우 배양에 사용할 플라스크이나 시험관 등에 넣어서 멸균하여 사용하고, 고체 배지의 경우 플라스크에 넣어서 멸균한 다음, 굳기 전에 청정실험대에서 페트리 접시(petri dish) 등에 적당량을 부은 뒤 굳혀서 사용합니다. 또한 공기 중에 존재하는 다른 세균, 곰팡이 등과 혼합되지 않도록 배지에 세균을 접종할 때는 청정실험대에서 작업해야 합니다.

한편 세균들은 선호하는 온도가 다르기 때문에 최적화된 온도에서 배양해야 빠르게 배양할 수 있는데, 대장균의 경우 37oC에서 가장 빠르게 성장합니다. 그리고 산소 선호도도 세균을 배양할 때 고려해야 할 대상입니다. 한편 세균마다 산소 선호도도 다르기 때문에 이에 따라 산소 공급 여부를 결정하여 배양해야 합니다. 대장균의 경우, 조건부 혐기성 세균이므로 산소의 공급 여부와 관계없이 배양은 할 수 있지만, 산소를 충분히 공급해 주면 더 빨리 배양할 수 있게 됩니다. 산소를 충분히 공급하기 위한 방법으로, 플라스크나 시험관에 배지를 넣을 때는 플라스크나 시험관 전체 용량보다 훨씬 적은 양의 배지를 넣고(통상 용량의 1/5 이하), 진탕 배양기(shaking incubator)를 이용하여 충분히 흔들어 주도록 합니다. 그리고 대량으로 배양할 경우 발효기(fermenter)를 이용하기도 하는데, 이 경우 발효기에 장착된 프로펠러를 돌리면서 산소를 충분하게 공급합니다.

그림 3. 세균을 배양할 때 고려할 요소들. 배양하고자 하는 세균의 특성을 파악하여 배지, 오염 방지, 온도, 산소를 고려하여 배양하도록 해야 합니다.

이번 시간에는 세균을 키우는 원리에 대해 알아보았습니다. 세균은 유전공학적으로 형질전환하여 유전자에 대해 연구하고, 대량의 단백질을 생산할 때 매우 유용하게 활용할 수 있기에 세균을 키우는 원리에 대해 알아보는 것은 매우 중요합니다. 다음 시간에는 세균을 키우는 구체적인 방법에 대해 알아보겠습니다.

주1) 제4위험군에 속하는 생물체로는 에볼라바이러스 등이 있습니다.
주2) 병원성 대장균은 제2위험군에 속합니다.
주3) 흔히 LB는 Luria broth, Luria-Bertani medium, Lennox broth 등으로 잘못 알려져 있지만, LB를 처음 만든 Giuseppe Bertani에 따르면 lysogeny broth의 약자입니다4).
 

*참고 문헌
1) Smith AC and Hussey MA. Gram stain protocols. American Society of Microbiology Education (2005)
2) 질병관리본부 국립보건연구원. 병원체 생물안전정보집(제2∙3∙4위험군). (2019.08.)
3) Croxen MA and Finlay BB. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nat Rev Microbiol. 8:26-38, 2010
4) Bertani G. Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. J Bacteriol. 186:595-600, 2004.